称取2g粉样于10mL离心管中，加入5mL CTAB裂解液(含适量RNA酶)，混匀60℃水浴振荡保温1h；2000r／min离心5min；取上清液，加等体积三氯甲烷一异戊醇(24：1)混匀，静置5min，8000r／min离心5min；小心取离心上清液，再加等体积三氯甲烷一异戊醇 (24：1)混匀，静置5min，8000r／min离心5min；取离心上清液加0.65倍体积的异丙醇。 混匀，12000r／min 4℃离心5min；弃上清液，加500μL 70％冰乙醇洗涤一次，12000r/min4℃离心5min；弃上清液，将沉淀晾干，加入50μL TE，溶解沉淀(4℃过夜，或37℃保温1h)；此即为总DNA提取液。也可用相应的售DNA提取试剂盒提取DNA。
2．PCR定性检测
(1)PCR反应体系。检测转基因玉米中内源基因和外源基因的PCR反应体系。
每个反应体系应设置两个平行反应。以转基因玉米或已知相应阳性质粒作为阳性对照，非转基因玉米作为阴性对照，以水代替模板DNA作为空白对照。
(2)PCR反应循环参数 94℃预变性2min，94℃变性40s，55～58℃退火60s(具体退火温度详见11-10)，72℃延伸60s，35个循环。72℃延伸5min。4℃保存。也可根据不同的基因扩增仪对PCR反应循环参数做适当调整。
(3)PCR扩增产物电泳检测。用电泳缓冲液(1×TBE或TAE)制备2％琼脂糖凝胶(其中在55～60℃加入EB或其他染色剂至终浓度为0.5μg/μL，也可在电泳后进行染色)。将10～μL PCR扩增产物分别和2μL上样缓冲液混合，进行点样。氨基酸检测机构用100bp梯带DNA标记物(Ladder DNA Marker)或相应合适的DNA标记物(DNA Marker)作分子量标记。3～5V／cm恒压，电泳20～40min。凝胶成像仪观察并分析记录。
(4)结果判断
①内源基因的检测用针对玉米内源的IVR基因(或Zein基因)设计的引物对玉米DNA提取液进行PCR测试，阴性对照、阳性对照和待测样品均应被扩增出226bp(或3bp)的PCR产物。如未见有该PCR产物扩增，则说明DNA提取质量有问题，或DNA提取液中有抑制PCR反应的因子存在，应重新提取DNA，直到扩增出该PCR产物。
②外源基因的检测对玉米样品DNA提取液进行外源基因的PCR测试，如果阴性对照和空白对照未出现扩增条带，阳性对照和待测样品均出现预期大小的扩增条带扩增片段长度，则可初步判定待测样品中含有可疑的该外源基因，应进一步进行确证试验，依据确证试验的结果做报告；如果待测样品中未出现PCR扩增产物，则可断定待测样品中不含有该外源基因。
③氨基酸检测机构选检测和鉴定检测的选择，对玉米样品中转基因成分的检测，可先选检测CaMV35S、NOS、NPT、PAT、BAR基因，选检测结果阴性则直接报告结果。
若选检测结果阳性，则需进一步鉴定检测IVS2／PAT、Maize genome／CaMV35S、HSP70/CryIAb、CDPK／CrylAb、CaMV 35S／PAT、PAT／CaMV 5S、CaMV 35S／Cry9C、Cry9C／CaMV35S、PactinI／mEPSPS、OTP／mEPSPS基因，以确定是何种转基因玉米品系。
(5)确证试验样品检测为阳性结果时需要用实时荧光PCR来确证。
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原标题：为玉米创建“指纹” 快速鉴定玉米种子 来源：千龙网
日前，记者从北京种业大会获悉，由北京农林科学院玉米研究中心（以下简称玉米中心）研发建立的全球数量更大的玉米标准DNA指纹库，凭数万张玉米“分子身份证”，让玉米品种中的“伪装者”无处遁形。
什么是DNA指纹技术呢？北京农林科学院玉米研究中心赵久然介绍：“人的身份证信息都是外在的、直截了当的，而玉米的‘分子身份证’则是采用DNA指纹技术，深入基因水平，用每个品种的特殊基因片段进行标记。
就像每个人都有自己独一无二的身份证一样，DNA指纹技术能够从DNA分子水平给每个玉米品种一个“身份证码”，以其准确可靠、简单快速、易于自动化的优点越来越多的应用于品种管理，克服一品多名和一名多品的现象。因此构建我国玉米品种标准DNA指纹库，对规范种业场以及对玉米新品种权进行保护具有重要意义。
目前此项技术处于前沿水平，它成功地应用于新品种试、审定和种子质量监控等方面；并对品种权保护和在品种权纠纷案件中的鉴定提供了技术支撑；在种子纯度的快速鉴定上节约了时间，减少人力、物力、财力的开支，过去的做法是每年抽检，田间做试验少则三个月、多则半年出结果，如今有了玉米标准DNA指纹库，当天检测当天就能出结果。
据了解，北京农林科学院玉米研究中心从95年起开始DNA指纹技术在玉米纯度及真伪检测方面的应用研究，随着玉米种质的不断扩增和创新，新品种的不断选育，DNA指纹库中的品种数量也将不断增加和扩充。目前采取普遍应用的SSR分子标记技术，经过十几年的深入系统研究，数万次样品的检测实践，刑成了独特的核心引物组合法，确定了适于建库和真实性鉴定的一套核心SSR引物组合；建立了玉米标准DNA指纹库构建的技术体系，并形成标准和规范；开发了兼容多作物、多平台的DNA指纹数据库管理系统；构建了国内首个库容达8万多个玉米品种的标准SSR-DNA指纹数据库。
在SSR分子指纹鉴定研究基础上，研制形成集品种鉴定、品种确权、分子育种等多用途为一体的高密度maize6H-60K芯片；建立了高通量的SNP分子鉴定技术体系；率先完成包含2万多个玉米品种的SNP-DNA标准指纹数据库。
目前，玉米标准DNA指纹库在玉米品种试审定、新品种保护、场监测、鉴定等多个领域得到广泛应用，使玉米成为我国乃至上DNA指纹技术应用更成熟、应用案例更多的作物，为解决种源“卡脖子”、打好种业翻身仗，提供了强有力的科技支撑。
玉米品种京科968SSR-DNA标准指纹图谱
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2023-12-01
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